UFL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407950-ACT

UFL1 codifica uma ligase E3 que catalisa a UFMilação (UFMylation), uma via de modificação do tipo ubiquitina importante para a homeostase do retículo endoplasmático (RE) e para a proteostase. Ao coordenar a conjugação de UFM1 a substratos específicos, a UFL1 influencia a sinalização de estresse do RE, o controle de qualidade de proteínas e vias ligadas à vigilância associada aos ribossomos e ao processamento de proteínas secretórias. Alterações na atividade de UFL1 têm sido associadas na literatura a respostas celulares ao estresse desreguladas e à sinalização inflamatória, fornecendo uma conexão mecanística com fenótipos relevantes para doenças em tecidos com alta demanda de dobramento proteico. Como resultado, a UFL1 é frequentemente estudada em modelos que investigam a adaptação ao estresse do RE, a sobrevivência celular sob estresse proteotóxico e a comunicação entre vias de modificadores do tipo ubiquitina e a regulação da imunidade inata.

UFL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UFL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UFL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UFL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UFL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UFL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UFL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UFL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UFL1 em células tumorais com expressão de UFL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.