Plásmido CRISPR de Activación (h) UFL1: sc-407950-ACT

UFL1 codifica una ligasa E3 que cataliza la UFMilación, una vía de modificación tipo ubiquitina importante para la homeostasis del retículo endoplásmico y la proteostasis. Al coordinar la conjugación de UFM1 a sustratos específicos, UFL1 influye en la señalización del estrés del RE, el control de calidad proteico y vías vinculadas a la vigilancia asociada a ribosomas y al manejo de proteínas secretoras. En la bibliografía, la actividad alterada de UFL1 se ha asociado con respuestas celulares al estrés desreguladas y con la señalización inflamatoria, proporcionando una conexión mecanística con fenotipos relevantes para enfermedades en tejidos con alta demanda de plegamiento proteico. Como resultado, UFL1 se estudia con frecuencia en modelos que investigan la adaptación al estrés del RE, la supervivencia celular bajo estrés proteotóxico y la comunicación cruzada entre modificadores tipo ubiquitina y la regulación de la inmunidad innata.

UFL1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UFL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UFL1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UFL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UFL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UFL1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UFL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UFL1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UFL1 en células tumorales con expresión de UFL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.