Plasmide CRISPR d'Activation (h) UDP-GlcDH: sc-405002-ACT

UGDH code l’UDP-glucose 6-déshydrogénase (UDP-GlcDH), une oxydoréductase cytosolique qui catalyse la conversion de l’UDP-glucose en UDP-acide glucuronique, un nucléotide-sucre activé essentiel à la biosynthèse des glycosaminoglycanes et des protéoglycanes. En fournissant de l’UDP-acide glucuronique, l’UDP-GlcDH soutient l’assemblage de la matrice extracellulaire, les programmes d’adhésion et de migration cellulaires, ainsi qu’un métabolisme plus large des glycoconjugués qui influence la signalisation des récepteurs et le remodelage tissulaire. Une activité altérée d’UGDH a été associée à des modifications de la composition de l’acide hyaluronique et d’autres glycosaminoglycanes, avec des liens rapportés avec l’invasivité des cellules tumorales, le remodelage de la matrice lié à la fibrose et la dynamique des microenvironnements inflammatoires. En tant que régulateur clé des interconversions des UDP-sucres, UGDH est souvent étudié dans des voies reliant la disponibilité en nucléotides-sucres à la mécanotransduction et aux transitions épithélio-mésenchymateuses.

UDP-GlcDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UGDH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UDP-GlcDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UGDH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UGDH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UDP-GlcDH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UGDH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UDP-GlcDH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UDP-GlcDH dans les cellules tumorales présentant une expression de UGDH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.