Plásmido CRISPR de Activación (h) UBC13: sc-417204-ACT

El gen humano UBE2N codifica la enzima E2 conjugadora de ubiquitina UBC13, un catalizador central de la poliubiquitinación enlazada a Lis63 que modula salidas de señalización no proteolíticas. En complejo con cofactores UEV como UBE2V1/UBE2V2, UBC13 favorece el ensamblaje de cadenas de ubiquitina K63 que coordinan las respuestas al daño del ADN, la tolerancia al estrés de replicación y la señalización de la inmunidad innata. Esta actividad es clave para la activación de vías como NF-κB y MAPK aguas abajo de receptores como TNFR y los receptores tipo Toll, e influye en la dinámica de complejos proteicos más que en la degradación por el proteasoma. La desregulación de la señalización por ubiquitina dependiente de UBE2N/UBC13 se ha implicado en estados inflamatorios alterados, defectos de estabilidad genómica y reconfiguración de vías oncogénicas, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos en biología del cáncer e inmunología.

UBC13 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UBE2N sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UBC13 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UBE2N en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UBE2N, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UBC13. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UBE2N y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UBC13 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UBC13 en células tumorales con expresión de UBE2N silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.