Plásmido CRISPR de Activación (h) UBC12: sc-403119-ACT

UBE2M codifica la enzima E2 conjugadora de neddilación UBC12, un componente central de la vía de NEDD8 que activa las ligasas de ubiquitina cullin-RING (CRL) mediante la neddilación de cullinas. Al promover la actividad de las CRL, UBC12 influye en el recambio dependiente de ubiquitina de reguladores que controlan la progresión del ciclo celular, el licenciamiento de la replicación del ADN y la señalización sensible al estrés, moldeando así la proteostasis y el control de los puntos de control. La alteración del circuito de neddilación se ha vinculado con una proliferación desregulada y con respuestas modificadas al estrés proteotóxico y genotóxico en múltiples contextos patológicos, lo que convierte a UBE2M en un nodo útil para estudiar redes de modificaciones tipo ubiquitina. La función de UBC12 en humanos también es relevante para investigaciones sobre vías de homeostasis proteica que se entrecruzan con la señalización inflamatoria y programas transcripcionales oncogénicos.

UBC12 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UBE2M sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UBC12 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UBE2M en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UBE2M, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UBC12. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UBE2M y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UBC12 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UBC12 en células tumorales con expresión de UBE2M silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.