Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBC12: sc-403119-ACT

UBE2M code l’enzyme de conjugaison E2 de la neddylation UBC12, un composant central de la voie NEDD8 qui active les ubiquitine-ligases de type culline‑RING (CRL) via la neddylation des cullines. En favorisant l’activité des CRL, UBC12 influence le renouvellement dépendant de l’ubiquitine de régulateurs contrôlant la progression du cycle cellulaire, l’octroi de licence de réplication de l’ADN et les voies de signalisation répondant au stress, façonnant ainsi la protéostasie et le contrôle des points de contrôle. La perturbation du circuit de neddylation a été associée à une prolifération dérégulée et à des réponses modifiées au stress protéotoxique et génotoxique dans de multiples contextes pathologiques, faisant d’UBE2M un nœud utile pour l’étude des réseaux de modifications de type ubiquitine. La fonction d’UBC12 chez l’humain est également pertinente pour l’exploration des voies d’homéostasie protéique qui recoupent la signalisation inflammatoire et des programmes transcriptionnels oncogéniques.

UBC12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2M sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBC12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2M dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2M, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBC12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2M natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBC12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBC12 dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2M silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.