U2AF65 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402059-ACT

Das humane Gen **U2AF2** kodiert **U2AF65**, eine wesentliche Komponente des U2‑Hilfs‑Spleißfaktors, der den Polypyrimidin‑Trakt an 3′‑Spleißstellen erkennt und während des Prä‑mRNA‑Spleißens die Rekrutierung des U2‑snRNP fördert. Über seine RNA‑Erkennungsmotive und die Interaktion mit Spleißpartnern trägt U2AF65 dazu bei, Exon‑Intron‑Grenzen zu definieren und den Aufbau des Spleißosoms zu koordinieren, was Programme des alternativen Spleißens und die Integrität des Transkriptoms beeinflusst. Das U2AF2‑abhängige Spleißen ist eng mit der Kontrolle der Genexpression gekoppelt und kann Signalwege modulieren, die an der Zellzyklusregulation, DNA‑Schadensantworten und dem RNA‑Stoffwechsel beteiligt sind. Eine fehlregulierte U2AF2‑Expression oder ein Ungleichgewicht im Spleißfaktor‑Netzwerk wurde mit einer aberranten Nutzung von Isoformen in verschiedenen Krebs‑ und hämatologischen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was U2AF2 zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien zu spleißgetriebenen Phänotypen macht.

U2AF65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen U2AF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

U2AF65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des U2AF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der U2AF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen U2AF65-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native U2AF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von U2AF65-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des U2AF65-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem U2AF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.