tsg 101 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423524-ACT

Tsg101 codifica il gene 101 di suscettibilità ai tumori, un componente centrale del complesso ESCRT-I che coordina lo smistamento endosomiale, la biogenesi dei corpi multivescicolari e il traffico ubiquitina-dipendente delle proteine di membrana. Nelle cellule murine, tsg101 sostiene le vie di degradazione lisosomiale, la downregulation dei recettori e gli eventi di rimodellamento di membrana legati alla citocinesi e all’autofagia. Attraverso il suo ruolo nella scissione di membrana mediata da ESCRT, Tsg101 influenza la biogenesi degli esosomi e il gemmamento virale, processi spesso sfruttati in modelli di infezione e di segnalazione intercellulare. La deregolazione della funzione ESCRT e l’alterata espressione di Tsg101 sono state associate, in sistemi sperimentali, a proliferazione cellulare anomala, instabilità genomica e fenotipi oncogenici, rendendolo rilevante per lo studio della biologia cellulare correlata al cancro.

tsg 101 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tsg101 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

tsg 101 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tsg101 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tsg101, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di tsg 101. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tsg101 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da tsg 101 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via tsg 101 nelle cellule tumorali con espressione di Tsg101 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.