Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRPV4: sc-401432-ACT

TRPV4 code un canal ionique TRP mécanorécepteur, perméable au Ca2+, qui intègre des stimuli osmotiques, thermiques et mécaniques afin de réguler l’excitabilité membranaire et la signalisation calcique intracellulaire. L’activité de TRPV4 se couple à des voies en aval incluant la signalisation dépendante de la calmoduline, les cascades MAPK et le remodelage du cytosquelette, influençant des processus tels que la fonction de barrière épithéliale, les réponses endothéliales au cisaillement et la mécanotransduction des chondrocytes. Dans les tissus humains, TRPV4 contribue à la transduction sensorielle et à l’homéostasie du volume au sein de divers types cellulaires. Une altération de la signalisation TRPV4 a été associée à une pathophysiologie allant des mécanismes de douleur neuropathique aux dysplasies squelettiques, ainsi qu’à des dysfonctions pulmonaires et vasculaires, ce qui en fait une cible utile pour étudier les réseaux de signalisation Ca2+ dépendants des stimuli.

TRPV4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRPV4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRPV4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRPV4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRPV4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRPV4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRPV4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRPV4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRPV4 dans les cellules tumorales présentant une expression de TRPV4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.