TRPC7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403911-ACT

TRPC7 kodiert einen calciumpermeablen, nichtselektiven Kationenkanal der Familie der kanonischen transienten Rezeptorpotentialkanäle (TRPC). Er trägt zum rezeptorvermittelten Ca2+-Einstrom nach PLC-gekoppelter Rezeptorsignalgebung und der Bildung von Diacylglycerol bei. Durch die Formung der intrazellulären Ca2+-Dynamik beeinflusst TRPC7 die Membrandepolarisation und nachgeschaltete Signalknoten wie CaM-abhängige Signalwege, MAPK-Kaskaden und NFAT-gesteuerte Transkriptionsprogramme. Die TRPC7-Aktivität wurde mit der Regulation der zellulären Erregbarkeit, Sekretion und des Zytoskelett-Remodelings in unterschiedlichen Zelltypen in Verbindung gebracht. Veränderte TRP-Kanalsignalgebung, einschließlich einer Dysregulation der TRPC-Familie, wird häufig im Kontext einer aberranten Calcium-Homöostase untersucht, die für kardiovaskuläre, neurologische und proliferative Krankheitsphänotypen relevant ist.

TRPC7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPC7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRPC7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPC7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPC7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRPC7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPC7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRPC7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRPC7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPC7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.