Troponin T-FS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402885-ACT

TNNT3 kodiert das schnelle skelettmuskelspezifische Troponin T (Troponin T-FS), einen zentralen Bestandteil des Troponin-Komplexes, der Tropomyosin am dünnen Filament verankert und die Ca²⁺-Bindung mit der regulierten Aktin-Myosin-Querbrückenzyklen koppelt. Durch die Verknüpfung von Kalziumsignalgebung mit der Sarkomermechanik trägt Troponin T-FS dazu bei, Kontraktionskinetik, Kraftentwicklung und fasertyp-spezifische kontraktile Eigenschaften festzulegen. Die TNNT3-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen der Erregungs-Kontraktions-Kopplung und der myofibrillären Assemblierung, die Muskelperformance und strukturelle Integrität prägen. Eine Fehlregulation oder Variation schneller Troponin-Komponenten wurde mit veränderter Kontraktilität und myopathischen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch TNNT3 ein nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung der Skelettmuskelbiologie und krankheitsrelevanter kontraktiler Umbauprozesse ist.

Troponin T-FS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNNT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Troponin T-FS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNNT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNNT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Troponin T-FS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNNT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Troponin T-FS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Troponin T-FS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNNT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.