Plasmide CRISPR d'Activation (h) Troponin T-C: sc-400949-ACT

TNNT2 code la troponine T cardiaque, un composant central du complexe de troponine qui ancre les sous-unités régulatrices au filament fin et convertit les signaux Ca²⁺ en interactions actine–myosine coordonnées. En modulant le positionnement de la tropomyosine sur l’actine F, TNNT2 contribue à déterminer la cinétique et la sensibilité de la contraction et de la relaxation du sarcomère, en s’intégrant au couplage excitation–contraction et aux voies de gestion du calcium. Une expression ou une fonction altérée de TNNT2 perturbe l’organisation myofibrillaire et les performances contractiles, et TNNT2 est largement impliquée dans des phénotypes de cardiomyopathie, héréditaires comme acquis. En tant que marqueur de la lignée cardiaque et nœud fonctionnel de la signalisation sarcomérique, TNNT2 est fréquemment utilisée pour étudier la maturation des myocytes, les réponses au stress et les programmes transcriptionnels liés à la contractilité.

Troponin T-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNNT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Troponin T-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNNT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNNT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Troponin T-C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNNT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Troponin T-C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Troponin T-C dans les cellules tumorales présentant une expression de TNNT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.