Plasmide CRISPR d'Activation (h) Troponin I-C: sc-400466-ACT

TNNI3 code la troponine I cardiaque, la sous-unité inhibitrice du complexe troponine qui relie la dynamique du Ca²⁺ cytosolique à l’activation du sarcomère dans le muscle strié. En modulant l’interaction actine–myosine via une régulation dépendante du Ca²⁺ du positionnement de la tropomyosine, la troponine I-C contribue à déterminer la force contractile et la cinétique de relaxation au sein du filament fin des cardiomyocytes. La fonction de TNNI3 s’intègre au couplage excitation–contraction, à l’assemblage sarcomérique et à une signalisation dépendante de la phosphorylation qui ajuste la sensibilité des myofilaments au Ca²⁺. Des perturbations génétiques et régulatrices de TNNI3 sont associées à des phénotypes liés aux cardiomyopathies et à des mécanismes arythmogènes, ce qui en fait une cible centrale pour l’étude de la contractilité cardiaque et des réponses au stress myofibrillaire.

Troponin I-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNNI3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Troponin I-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNNI3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNNI3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Troponin I-C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNNI3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Troponin I-C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Troponin I-C dans les cellules tumorales présentant une expression de TNNI3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.