Plásmido CRISPR de Activación (m) Tropomyosin α: sc-423481-ACT

Tpm1 codifica la tropomiosina α, una proteína de tipo “coiled-coil” que se une a la actina y estabiliza la actina filamentosa, además de especificar las interacciones actomiosina en células estriadas y no musculares. Al regular la mecánica de los filamentos delgados, la organización del citoesqueleto y la transmisión de la fuerza contráctil, TPM1 contribuye a procesos como el control de la forma celular, la migración, la dinámica de adhesión y la contracción muscular. La función de TPM1 se solapa con vías de remodelación del citoesqueleto de actina, incluidas la señalización dependiente de GTPasas Rho y los programas de ensamblaje sarcomérico. La alteración de la expresión de TPM1 o del equilibrio entre sus isoformas se ha asociado con defectos en la organización miofibrilar y en la fisiología de los cardiomiocitos, lo que respalda su relevancia en modelos de miocardiopatía y en mecanismos de enfermedad relacionados con el citoesqueleto.

Tropomyosin α El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Tpm1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Tropomyosin α El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Tpm1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Tpm1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Tropomyosin α. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Tpm1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Tropomyosin α en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Tropomyosin α en células tumorales con expresión de Tpm1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.