Trk C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400854-ACT

NTRK3 codifica il recettore tirosin-chinasico Trk C, un recettore ad alta affinità per le neurotrofine che risponde principalmente alla neurotrofina-3, regolando la differenziazione neuronale, la sopravvivenza e la plasticità sinaptica. In seguito al legame con il ligando, Trk C attiva le vie canoniche di segnalazione dei recettori tirosin-chinasici tramite i pathway MAPK/ERK, PI3K/AKT e PLCγ, coordinando programmi trascrizionali e il rimodellamento del citoscheletro. Oltre ai ruoli nello sviluppo neurale e nel mantenimento dei circuiti, la deregolazione della segnalazione di NTRK3 e i riarrangiamenti genici sono stati associati ad alterazioni della segnalazione dei fattori di crescita, difetti nella specificazione di linea e attivazione di vie oncogeniche in molteplici contesti tumorali. Queste caratteristiche rendono Trk C un nodo utile per studiare la biologia delle neurotrofine, il traffico dei recettori e il crosstalk tra vie di segnalazione che influenzano le decisioni sul destino cellulare.

Trk C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NTRK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Trk C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NTRK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NTRK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Trk C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NTRK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Trk C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Trk C nelle cellule tumorali con espressione di NTRK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.