Plásmido CRISPR de Activación (h) Trio: sc-401231-ACT

El TRIO humano codifica Trio, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) de la familia Rho, de múltiples dominios, que activa GTPasas de la familia Rho, incluidas RAC1 y RHOA, para coordinar la remodelación del citoesqueleto de actina, la polaridad celular, la adhesión y la migración dirigida. A través de sus funciones GEF y de andamiaje, Trio integra señales de receptores tirosina cinasa, señales de guía y vías de integrinas para dar forma al crecimiento de neuritas, el desarrollo de sinapsis y el tráfico vesicular. La señalización dependiente de TRIO modula procesos vinculados a MAPK y PI3K e influye en programas transcripcionales aguas abajo de la dinámica del citoesqueleto. La actividad desregulada de TRIO y el control alterado de las GTPasas Rho se han implicado en fenotipos del neurodesarrollo y en comportamientos celulares relevantes para la invasión tumoral y el potencial metastásico, lo que respalda estudios mecanísticos de la motilidad y la formación de circuitos neuronales.

Trio El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRIO sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Trio El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRIO en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRIO, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Trio. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRIO y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Trio en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Trio en células tumorales con expresión de TRIO silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.