Plasmide CRISPR d'Activation (m) Triadin: sc-429407-ACT

Trdn chez la souris code la triadine, une protéine membranaire du réticulum sarcoplasmique jonctionnel qui organise le couplage excitation–contraction dans le muscle strié en servant de plateforme d’assemblage pour le récepteur à la ryanodine (RyR), la calséquestrine et des partenaires luminales associés. Au sein de ce complexe de libération du calcium, la triadine contribue à réguler le stockage du Ca²⁺ dans le RS et la cinétique de sa libération, reliant la dépolarisation membranaire à une contraction dépendante du Ca²⁺ et à des programmes de signalisation en aval sensibles au calcium. Une altération de la fonction de TRDN perturbe l’homéostasie du Ca²⁺, déstabilise le comportement du canal du récepteur à la ryanodine et est associée à des phénotypes musculaires et cardiaques liés à des mécanismes arythmogènes et myopathiques. Trdn est donc largement étudié dans les voies qui gouvernent l’architecture des jonctions du RS, la gestion du calcium et la fidélité du couplage excitation–contraction dans les cardiomyocytes et les fibres musculaires squelettiques.

Triadin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Trdn sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Triadin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Trdn dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Trdn, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Triadin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Trdn natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Triadin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Triadin dans les cellules tumorales présentant une expression de Trdn silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.