TPO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417243-ACT

O THPO humano codifica a trombopoietina (TPO), uma citocina secretada que é o principal regulador da proliferação de megacariócitos e da produção de plaquetas. A TPO sinaliza principalmente por meio de MPL para ativar as vias JAK2/STAT5, PI3K/AKT e MAPK, sustentando a manutenção de células-tronco e progenitoras hematopoéticas e o comprometimento de linhagens. A sinalização THPO–MPL desregulada tem sido associada a alterações na homeostase plaquetária e contribui para a fisiopatologia de neoplasias mieloproliferativas e outros distúrbios da hematopoiese. Como um fator endócrino predominantemente hepático, com controle por retroalimentação pela massa plaquetária, o THPO oferece um ponto de intervenção adequado para estudar programas transcricionais mediados por citocinas e a sinalização do nicho hematopoético.

TPO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de THPO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus THPO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição THPO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus THPO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPO em células tumorais com expressão de THPO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.