TPCN2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402960-ACT

TPCN2 (Two-Pore-Segment-Kanal 2) kodiert einen endolysosomalen Kationenkanal, der die Ca²⁺-Freisetzung aus sauren intrazellulären Speichern als Antwort auf NAADP und verwandte Signale reguliert und dadurch Membrantransport, Organellexzitabilität und Vesikelfusion koordiniert. Durch die Prägung der Endosom–Lysosom-Dynamik und der ionischen Homöostase beeinflusst TPCN2 Autophagie, Rezeptor-Recycling und nährstoffsensorische Prozesse, die mit der mTOR-Signalgebung verknüpft sind. Eine veränderte TPCN2-Aktivität wurde mit Veränderungen der Pigmentierungsbiologie, metabolischen Phänotypen und Programmen der zellulären Invasion in Verbindung gebracht, was es für Studien zur lysosomalen Funktion und Stressanpassung relevant macht. Die Untersuchung von TPCN2 bietet einen Ansatz, um zu klären, wie endolysosomale Ca²⁺-Signalgebung mit Zytoskelett-Remodelling und dem Crosstalk zwischen Organellen in menschlichen Zellen zusammenwirkt.

TPCN2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPCN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TPCN2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPCN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPCN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TPCN2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPCN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TPCN2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TPCN2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPCN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.