Plásmido CRISPR de Activación (h) TPCN2: sc-402960-ACT

TPCN2 (canal de segmento de dos poros 2) codifica un canal catiónico endolisosomal que regula la liberación de Ca²⁺ desde depósitos intracelulares ácidos en respuesta a NAADP y señales relacionadas, coordinando el tráfico de membranas, la excitabilidad de los orgánulos y la fusión vesicular. Al modular la dinámica endosoma–lisosoma y la homeostasis iónica, TPCN2 influye en la autofagia, el reciclaje de receptores y procesos de detección de nutrientes vinculados a la señalización de mTOR. La actividad alterada de TPCN2 se ha asociado con cambios en la biología de la pigmentación, fenotipos metabólicos y programas de invasión celular, lo que la hace relevante para estudios sobre la función lisosomal y la adaptación al estrés. Investigar TPCN2 ofrece una vía para dilucidar cómo la señalización endolisosomal de Ca²⁺ se integra con la remodelación del citoesqueleto y la comunicación entre orgánulos en células humanas.

TPCN2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TPCN2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TPCN2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TPCN2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TPCN2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TPCN2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TPCN2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TPCN2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TPCN2 en células tumorales con expresión de TPCN2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.