TPCN1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404943-ACT

Humanes TPCN1 (Two-Pore Channel 1) kodiert einen endolysosomalen Kationenkanal, der die NAADP-sensitive Ca2+-Freisetzung aus sauren Organellen reguliert und dadurch intrazelluläre Calcium-Mikrodomänen mit dem Membrantransport koordiniert. Indem TPCN1 die Endosom-Lysosom-Dynamik, vesikuläre Fusion und die Erregbarkeit von Organellen beeinflusst, wirkt es auf Autophagie, Rezeptor-Recycling und Signalwege ein, die mit Zellstoffwechsel und Stressantworten verknüpft sind. Veränderte endolysosomale Ca2+-Handhabung und mit der TPCN1-Aktivität assoziierte Transportphänotypen sind für Untersuchungen zu Neurodegeneration, kardiometabolischer Dysfunktion und Mechanismen des Wirts-Pathogen-Eintritts relevant. Daher wird TPCN1 häufig in Modellen untersucht, die lysosomale Funktion mit Ca2+-abhängiger Signaltransduktion und Proteostase verknüpfen.

TPCN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPCN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TPCN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPCN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPCN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TPCN1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPCN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TPCN1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TPCN1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPCN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.