Topo IIβ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400773-ACT

TOP2B codifica a DNA topoisomerase IIβ humana (Topo IIβ), uma enzima dependente de ATP que resolve o superenrolamento e a catenação do DNA ao criar quebras transitórias de dupla fita e religar o DNA durante a transcrição e a remodelação da cromatina. A Topo IIβ dá suporte à organização do genoma e à regulação gênica de longa distância, contribuindo para programas de transcrição dependentes da RNA polimerase II e para a manutenção da estabilidade genômica. Sua atividade se cruza com a sinalização da resposta a dano no DNA, o controle topológico ligado ao ciclo celular e mudanças transcricionais associadas à diferenciação. A desregulação da função ou da expressão de TOP2B tem sido associada a paisagens transcricionais alteradas, fenótipos de instabilidade genômica e respostas ao estresse relevantes para doenças, estudadas na biologia do câncer, na neurobiologia e em mecanismos de cardiotoxicidade.

Topo IIβ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TOP2B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Topo IIβ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TOP2B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TOP2B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Topo IIβ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TOP2B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Topo IIβ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Topo IIβ em células tumorais com expressão de TOP2B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.