Plasmide CRISPR d'Activation (h) TopBP1: sc-402703-ACT

Le gène humain TOPBP1 code TopBP1, une protéine échafaudage essentielle à la stabilité du génome, qui coordonne l’initiation de la réplication de l’ADN et la réponse au stress réplicatif dépendante d’ATR. TopBP1 favorise l’activation d’ATR via son interaction avec ATRIP et participe à la signalisation des checkpoints, à la stabilisation des fourches de réplication et au choix des voies de réparation pendant la phase S et en réponse aux dommages de l’ADN. Par l’intermédiaire de ses domaines BRCT, elle organise des complexes multiprotéiques au niveau des fourches de réplication bloquées et de la chromatine endommagée, en intégrant la synchronisation de la réplication au contrôle des checkpoints. Une expression ou une fonction dérégulée de TOPBP1 a été associée à une augmentation du stress réplicatif, à l’instabilité chromosomique et à des défauts de maintenance génomique liés au cancer.

TopBP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TOPBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TopBP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TOPBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TOPBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TopBP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TOPBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TopBP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TopBP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TOPBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.