Plasmide CRISPR d'Activation (h) TOM40: sc-400967-ACT

Le gène humain **TOMM40** code **TOM40**, le pore central en tonneau β de la translocase de la membrane externe mitochondriale (complexe TOM), qui assure l’import des protéines codées par le noyau vers les mitochondries. En permettant la reconnaissance des précurseurs et leur translocation à travers la membrane externe, TOM40 soutient la protéostase mitochondriale, la capacité de phosphorylation oxydative et la coordination de la biogenèse mitochondriale avec le métabolisme cellulaire. La fonction de TOMM40 recoupe des voies impliquées dans la dynamique mitochondriale, la signalisation de stress et l’apoptose, via son rôle dans le maintien d’un trafic protéique efficace vers l’organite. Des variations génétiques et une dérégulation de l’import mitochondrial ont été associées à la neurodégénérescence et à d’autres troubles caractérisés par un dysfonctionnement mitochondrial, faisant de TOMM40 un nœud clé pour les études mécanistiques de l’homéostasie mitochondriale.

TOM40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TOMM40 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TOM40 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TOMM40 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TOMM40, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TOM40. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TOMM40 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TOM40 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TOM40 dans les cellules tumorales présentant une expression de TOMM40 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.