Plasmide CRISPR d'Activation (m) TNAP: sc-419068-ACT

Le gène murin **Alpl** code la phosphatase alcaline non spécifique des tissus (**TNAP**), une ectoenzyme ancrée par glycosylphosphatidylinositol qui hydrolyse des substrats extracellulaires contenant du phosphate afin de réguler l’équilibre local phosphate inorganique/pyrophosphate. En limitant le pyrophosphate, la TNAP favorise la minéralisation de la matrice et contribue à la fonction des ostéoblastes et des chondrocytes lors du développement et du remodelage du squelette. L’activité de la TNAP s’articule avec la signalisation purinergique et le métabolisme extracellulaire des nucléotides via la déphosphorylation de l’ATP, de l’ADP, de l’AMP et d’intermédiaires apparentés, modulant ainsi le dépôt minéral et le microenvironnement ostéogénique. Une dérégulation de la fonction **ALPL/TNAP** est associée à des défauts de minéralisation et à des phénotypes squelettiques pertinents pour des modèles d’hypophosphatasie, d’anomalies craniofaciales et de fragilité osseuse.

TNAP Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Alpl sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TNAP Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Alpl dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Alpl, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TNAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Alpl natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TNAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TNAP dans les cellules tumorales présentant une expression de Alpl silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.