Plásmido CRISPR de Activación (h) TMEM97: sc-411997-ACT

TMEM97 codifica una pequeña proteína transmembrana multipaso, también conocida como el receptor sigma-2, enriquecida en el retículo endoplásmico y en membranas lisosomales/endosomales, e implicada en el manejo intracelular del colesterol y el tráfico de membranas. TMEM97 se ha vinculado a la regulación de la distribución de esteroles mediante interacciones con complejos de transporte de lípidos y de receptores, influyendo en la dinámica vesicular y en las respuestas celulares al estrés. Se han reportado alteraciones en la expresión de TMEM97 en contextos proliferativos y neurodegenerativos, donde los cambios en la homeostasis lipídica, el estrés oxidativo y la proteostasis pueden contribuir a fenotipos asociados a enfermedad. Estas características hacen de TMEM97 una diana útil para estudios mecanísticos de señalización regulada por lípidos, función de orgánulos y transiciones de estado celular.

TMEM97 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TMEM97 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TMEM97 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TMEM97 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TMEM97, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TMEM97. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TMEM97 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TMEM97 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TMEM97 en células tumorales con expresión de TMEM97 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.