Plásmido CRISPR de Activación (h) TMEM38B: sc-412461-ACT

TMEM38B codifica el canal catiónico intracelular trimérico A (TRIC-A), una proteína de membrana del retículo endoplásmico/retículo sarcoplásmico (RE/RS) que forma canales para cationes monovalentes y favorece la liberación de Ca2+ al proporcionar un flujo de contraiones. Al estabilizar el potencial de membrana del RE/RS durante la señalización de calcio dependiente de los receptores de IP3 y de rianodina, TMEM38B contribuye al acoplamiento excitación–contracción, a la homeostasis del calcio intracelular y a programas de transcripción regulados por calcio aguas abajo. La alteración de la función de TMEM38B se ha relacionado con el desarrollo esquelético y la integridad del tejido conectivo, y se han asociado variantes con pérdida de función con fenotipos similares a la osteogénesis imperfecta. Estas características hacen que TMEM38B sea relevante para estudios mecanísticos del manejo de calcio en el RE, la biología de la matriz y las respuestas de señalización asociadas al estrés en células humanas.

TMEM38B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TMEM38B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TMEM38B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TMEM38B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TMEM38B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TMEM38B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TMEM38B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TMEM38B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TMEM38B en células tumorales con expresión de TMEM38B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.