Plasmide CRISPR d'Activation (h) TMEM191B: sc-417493-ACT

TMEM191B code une protéine transmembranaire multipasse prédite, dont l’annotation fonctionnelle dans les cellules humaines reste limitée, ce qui suggère des rôles liés à l’organisation membranaire et à une signalisation spécifique de compartiments. Des études transcriptomiques impliquent TMEM191B dans des programmes de régulation de l’état cellulaire qui se recoupent avec le trafic intracellulaire, la protéostase et les voies de réponse au stress, où les protéines membranaires modulent souvent la disponibilité des récepteurs et la propagation des signaux. Des profils d’expression altérés ont été observés dans certains jeux de données pertinents pour des maladies, ce qui soutient l’exploration de TMEM191B comme régulateur dépendant du contexte plutôt que comme gène largement essentiel. Une surexpression expérimentale peut aider à définir les réponses transcriptionnelles en aval, les partenaires d’interaction et la connectivité des voies dans des systèmes modèles immunitaires, épithéliaux ou cancéreux.

TMEM191B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM191B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TMEM191B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM191B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM191B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TMEM191B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM191B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TMEM191B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TMEM191B dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM191B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.