TIMP-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401255-ACT

TIMP3 kodiert TIMP-3, einen an die extrazelluläre Matrix gebundenen Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen, der Proteasen der ADAM- und MMP-Familie hemmt und damit die perizelluläre Proteolyse reguliert. Durch die Modulation des Sheddings von Membranproteinen und des Umsatzes von Matrixkomponenten beeinflusst TIMP-3 das ECM-Remodeling, Zelladhäsion, Migration und entzündliche Signalwege, einschließlich der TNFα-Verarbeitung über ADAM17. Eine veränderte TIMP-3-Expression oder -Aktivität wird mit fehlregulierter Fibrose, vaskulärem Remodeling und Dynamiken der Tumormikroumgebung in Verbindung gebracht; zudem sind pathogene Varianten mit retinalen degenerativen Phänotypen wie der Sorsby-Fundusdystrophie assoziiert. Diese Funktionen machen TIMP-3 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung des Protease–Inhibitor-Gleichgewichts bei Gewebehomöostase und krankheitsassoziierten Remodeling-Prozessen.

TIMP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TIMP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIMP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TIMP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TIMP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIMP-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TIMP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIMP-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIMP-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TIMP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.