Plásmido CRISPR de Activación (h) Tiam1: sc-400674-ACT

TIAM1 codifica Tiam1, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina específico de Rac1 que conecta señales upstream de receptores y de adhesión con la remodelación del citoesqueleto de actina, la polaridad celular y la migración dirigida. Mediante la activación de Rac1 y la coordinación con la señalización de GTPasas de la familia Rho, Tiam1 influye en la formación de lamelipodios, la dinámica de las uniones adherentes y la plasticidad epitelio-mesenquimal, intersectando con vías como la señalización de PI3K y la adhesión mediada por integrinas. Los programas dependientes de TIAM1 se han vinculado con el comportamiento invasivo y el potencial metastásico en múltiples contextos tumorales, y la alteración de la actividad de Tiam1 también es relevante para procesos del neurodesarrollo y la remodelación sináptica. Estas propiedades hacen de TIAM1 un nodo útil para estudiar la regulación del citoesqueleto, la estabilidad de los contactos célula-célula y las redes de transducción de señales que controlan la motilidad.

Tiam1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TIAM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Tiam1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TIAM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TIAM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Tiam1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TIAM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Tiam1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Tiam1 en células tumorales con expresión de TIAM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.