Plásmido CRISPR de Activación (h) TGR5: sc-401875-ACT

El GPBAR1 humano codifica TGR5, un GPCR activado por ácidos biliares que se acopla principalmente a Gαs para elevar el AMPc intracelular y modular la señalización posterior de PKA/CREB. TGR5 se expresa en diversos tipos celulares relevantes para el metabolismo y el sistema inmunitario, e integra señales de los ácidos biliares para regular la homeostasis energética, la actividad mitocondrial y el tono inflamatorio. La actividad de GPBAR1/TGR5 interactúa con vías que controlan el metabolismo de la glucosa y los lípidos, la polarización de macrófagos y la función de barrera en tejidos expuestos a ácidos biliares. La desregulación de la señalización de TGR5 se ha asociado con disfunción metabólica y procesos inflamatorios crónicos, lo que lo convierte en una diana útil para estudios mecanísticos de señalización de GPCR en contextos hepatobiliares y gastrointestinales.

TGR5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GPBAR1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TGR5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GPBAR1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GPBAR1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TGR5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GPBAR1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TGR5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TGR5 en células tumorales con expresión de GPBAR1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.