TGR5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401875-ACT

O GPBAR1 humano codifica o TGR5, um GPCR ativado por ácidos biliares que se acopla principalmente à Gαs para elevar o cAMP intracelular e modular a sinalização a jusante de PKA/CREB. O TGR5 é expresso em diversos tipos celulares relevantes para o metabolismo e para a imunidade e integra sinais de ácidos biliares para regular a homeostase energética, a atividade mitocondrial e o tônus inflamatório. A atividade de GPBAR1/TGR5 cruza-se com vias que controlam o metabolismo de glicose e lipídios, a polarização de macrófagos e a função de barreira em tecidos expostos a ácidos biliares. A desregulação da sinalização de TGR5 tem sido associada a disfunção metabólica e a processos inflamatórios crônicos, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de sinalização de GPCR em contextos hepatobiliares e gastrointestinais.

TGR5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPBAR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TGR5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPBAR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPBAR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TGR5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPBAR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TGR5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TGR5 em células tumorais com expressão de GPBAR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.