Plásmido CRISPR de Activación (h) TFIIH p62: sc-402239-ACT

GTF2H1 codifica la subunidad p62 de TFIIH, un componente central del complejo TFIIH que coordina el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa II con la reparación por escisión de nucleótidos (NER). TFIIH integra la apertura del promotor, la selección del sitio de inicio de la transcripción y el reconocimiento/reparación del daño en el ADN mediante interacciones con otras subunidades de TFIIH y factores de reparación, conectando la transcripción basal con el mantenimiento del genoma. La alteración de la función de TFIIH y los defectos en NER se asocian con sensibilidad a la radiación UV y con síndromes de reparación acoplada a la transcripción, lo que subraya la importancia de p62 en las respuestas celulares al estrés genotóxico. Como factor tipo andamiaje dentro de TFIIH, la p62 de TFIIH proporciona un punto de intervención manejable para analizar la comunicación cruzada entre la regulación transcripcional y las vías de reparación del ADN.

TFIIH p62 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GTF2H1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TFIIH p62 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GTF2H1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GTF2H1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TFIIH p62. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GTF2H1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TFIIH p62 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TFIIH p62 en células tumorales con expresión de GTF2H1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.