TF Plasmide KO CRISPR/Cas9 (m): sc-420268
- Specie Target: mouse
- 20 µg di DNA plasmidico purificato, pronto per trasfezione; sufficiente fino a 20 trasfezioni
- TF Il plasmide CRISPR/Cas9 Knockout (KO) (m) è un pool di plasmidi, ciascuno dei quali codifica la nucleasi Cas9 e un RNA guida (gRNA) specifico per il bersaglio di 20 nt, progettato per la massima efficienza di knockout utilizzando sequenze derivate dalla libreria GeCKO v2
- Le sequenze gRNA indirizzano Cas9 a indurre rotture a doppio filamento (DSB) sito-specifiche nel locus genomico TF, con conseguente knockout genico tramite giunzione non omologa (NHEJ)
- TF HDR Plasmid (m) (sc-420268-HDR) è raccomandato per la cotrasfezione con TF CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) per consentire la selezione delle cellule modificate con successo attraverso l'integrazione mediata da HDR di un cassetto di resistenza alla puromicina e del gene reporter RFP
- Il TF Plasmid HDR (m) è un pool di plasmidi, ciascuno contenente un modello di riparazione diretta dall'omologia (HDR) corrispondente ai siti bersaglio del gRNA nel TF Plasmid CRISPR/Cas9 KO (m)
- Ciascun plasmide HDR contiene due bracci di omologia di circa 800 bp che fiancheggiano i cassetti di resistenza alla puromicina e RFP, progettati per legarsi alle sequenze di DNA genomico che circondano il sito di rottura a doppio filamento indotto da Cas9 e facilitare l'integrazione precisa mediata da HDR
- I geni di resistenza alla puromicina e RFP sono fiancheggiati da siti LoxP, consentendo la rimozione dei marcatori di selezione tramite la ricombinasi Cre (Cre Vector: sc-418923) dopo aver stabilito linee cellulari knockout stabili
- In seguito alla trasfezione, l'efficienza dll'attivazione genica può essere testata con WB, IF o IHC utilizzando l'anticorpo: TF Antibody (H-9): sc-374441
Informazioni ordini
| Nome del prodotto | Codice del prodotto | UNITÀ | Prezzo | Quantità | Preferiti | |
TF Plasmide KO CRISPR/Cas9 (m) | sc-420268 | 20 µg | $397.00 | |||
TF Plasmide HDR (m) | sc-420268-HDR | 20 µg | $445.00 |
Panoramica
Il gene murino F3 codifica il fattore tissutale (TF), un recettore transmembrana che avvia la cascata della coagulazione estrinseca legandosi al fattore VII/VIIa e promuovendo la successiva attivazione del fattore X e la generazione di trombina. Oltre all’emostasi, il TF partecipa alla biologia vascolare collegando la segnalazione mediata da proteasi alle vie dei recettori attivati da proteasi (PAR) e influenzando l’attivazione endoteliale, l’infiammazione e la funzione di barriera. L’espressione di TF è strettamente regolata nei compartimenti immunitario e stromale ed è frequentemente studiata in contesti di trombosi, danno vascolare e rimodellamento tissutale infiammatorio. Un’attività di TF deregolata è stata associata a stati protrombotici e contribuisce a processi rilevanti per la malattia, come la coagulazione associata ai tumori e la coagulopatia correlata alla sepsi in modelli sperimentali.
TF Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (m) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene F3 in mouse linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus F3, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.
Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.
Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP
Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il TF Plasmide HDR (m) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito F3.
Se cotrasfettato con il TF Plasmide CRISPR/Cas9 KO (m):
- La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto F3.
La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.
Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox
Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus F3 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:
- Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche
Caratteristiche principali
- gRNA mirato agli esoni F3 critici per la funzione TF
Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione
Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.