TET2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400545-ACT

Humanes TET2 kodiert eine Fe(II)/2‑Oxoglutarat‑abhängige Dioxygenase, die 5‑Methylcytosin zu 5‑Hydroxymethylcytosin und weiteren Derivaten oxidiert und dadurch aktive wie auch passive DNA‑Demethylierung fördert. Über die Regulation der Methylierungszustände von Enhancern und Promotoren formt TET2 Transkriptionsprogramme, die hämatopoetische Differenzierung, Selbsterneuerung und die Festlegung von Immunzell‑Linien steuern. Die TET2‑Funktion ist in epigenetische Signalwege eingebettet, an denen Chromatin‑Modifikatoren sowie DNA‑Reparatur‑assoziierte Prozesse zur Verarbeitung oxidierter Cytosinbasen beteiligt sind, und beeinflusst so die genomweite Chromatinzugänglichkeit und die Stabilität der Genexpression. Eine Fehlregulation oder Mutation von TET2 ist häufig mit klonaler Hämatopoese und der Biologie myeloischer Malignome assoziiert und macht TET2 zu einem zentralen Ziel für mechanistische Studien epigenetischer Umprogrammierung in krankheitsrelevanten Zellsystemen.

TET2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TET2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TET2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TET2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TET2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TET2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TET2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TET2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TET2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TET2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.