TCP-1 ε CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402993-ACT

CCT5 kodiert die humane TCP-1-ε‑Untereinheit des TRiC/CCT‑Chaperonin-Komplexes, einer ATP-abhängigen Faltungsmaschine, die die Reifung neu synthetisierter sowie stressbedingt denaturierter Proteine im Zytosol fördert. TRiC unterstützt die Proteostase, indem es die Faltung zentraler Substrate wie Aktin und Tubulin erleichtert und dadurch die Organisation des Zytoskeletts, den vesikulären Transport und den Zellzyklusverlauf beeinflusst. Eine Beeinträchtigung der Chaperonin-Kapazität kann die Stabilität des Proteoms und Stressantworten verändern und verknüpft die Funktion von CCT5/TCP-1 ε mit Signalwegen, die die zelluläre Fitness unter proteotoxischen Bedingungen prägen. Fehlregulierte Chaperon-Aktivität und gestörte Faltungsnetzwerke werden häufig im Kontext von Neurodegeneration und Krebsbiologie untersucht, da sie zur Proteinaggregation, zu Ungleichgewichten in der Signalübertragung und zu veränderten Proliferationsprogrammen beitragen können.

TCP-1 ε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCT5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCP-1 ε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCT5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCT5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCP-1 ε-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCT5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCP-1 ε-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCP-1 ε-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCT5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.