Plasmide CRISPR d'Activation (h) TCP-1 α: sc-402699-ACT

TCP1 code pour TCP-1 alpha, une sous-unité centrale du complexe chaperon cytosolique contenant TCP1 (CCT/TRiC), qui replie et stabilise des protéines à topologies complexes, notamment l’actine et la tubuline. En régulant la protéostasie du cytosquelette, CCT soutient la dynamique des microtubules et de l’actine, la progression du cycle cellulaire et des processus de trafic liés aux réseaux de protéostasie. La fonction de TCP-1 alpha s’articule avec les voies de réponse au stress et de contrôle qualité des protéines, qui déterminent la manière dont les cellules gèrent les clients mal repliés ou sujets à l’agrégation. Une activité chaperonine dérégulée et une expression modifiée de TCP1 ont été associées à des phénotypes pertinents pour la croissance oncogénique, la neurodégénérescence et les déséquilibres de protéostasie, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques.

TCP-1 α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TCP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TCP-1 α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TCP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TCP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TCP-1 α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TCP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TCP-1 α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TCP-1 α dans les cellules tumorales présentant une expression de TCP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.