Plásmido CRISPR de Activación (h) TBCK: sc-409581-ACT

TBCK (quinasa que contiene el dominio TBC1) codifica un regulador citosólico multidominio implicado en el tráfico de membranas y el control del crecimiento, con funciones descritas en procesos asociados a las GTPasas Rab y en redes de señalización que influyen en la homeostasis celular. En humanos, TBCK se ha relacionado con la modulación de vías asociadas a mTOR y con la función del eje autofagia–lisosoma, lo que lo conecta con mecanismos que regulan el tamaño celular, el metabolismo y las respuestas al estrés. La actividad alterada de TBCK se ha asociado con fenotipos del neurodesarrollo y trastornos sindrómicos, lo que respalda su relevancia para estudiar el mantenimiento neuronal, la proteostasis y la desregulación de la señalización. Estas propiedades hacen de TBCK una diana útil para estudios mecanísticos del transporte intracelular y del crosstalk entre vías.

TBCK El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TBCK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TBCK El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TBCK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TBCK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TBCK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TBCK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TBCK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TBCK en células tumorales con expresión de TBCK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.