Plasmide CRISPR d'Activation (h) TAZ: sc-400320-ACT

WWTR1 code le coactivateur transcriptionnel TAZ (TAFAZ), un effecteur central de la voie de signalisation Hippo qui relie le contact cellule–cellule, les signaux mécaniques et la polarité à des programmes transcriptionnels contrôlant la prolifération, la différenciation et la croissance tissulaire. Lorsque les kinases Hippo sont inactives, TAZ s’accumule dans le noyau et coopère avec les facteurs de transcription de la famille TEAD pour réguler des gènes impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire, la plasticité épithélio-mésenchymateuse et des états cellulaires de type « stem ». Une activité aberrante de WWTR1/TAZ est associée à une mécanotransduction dérégulée et à une spécification de lignée altérée dans de multiples contextes pathologiques, notamment des programmes transcriptionnels liés au cancer et le remodelage fibrotique. Ces caractéristiques font de TAZ un nœud largement utilisé pour étudier les sorties YAP/TAZ–TEAD, les interactions avec les voies Wnt et TGF-β, ainsi que le contrôle transcriptionnel dépendant du contexte.

TAZ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WWTR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TAZ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WWTR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WWTR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TAZ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WWTR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TAZ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TAZ dans les cellules tumorales présentant une expression de WWTR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.