TAT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405240-ACT

Humanes **TAT** kodiert die Tyrosin-Aminotransferase, ein zytosolisches, pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das den ersten Schritt des Tyrosinabbaus katalysiert, indem es L‑Tyrosin zu p‑Hydroxyphenylpyruvat umsetzt. Diese Reaktion verknüpft den Umsatz von Aminosäuren mit der hepatischen Stickstoffverarbeitung und nachgeschalteten Signal- und Stoffwechselwegen, die in den Energiestoffwechsel und die Redox-Homöostase einmünden. Die TAT-Expression wird streng durch hormonelle und nutritive Signale reguliert und integriert Transkriptionsprogramme, die auf Glukokortikoide und Fastenzustände reagieren. Störungen des Tyrosinabbaus sind mit erblichen Stoffwechselerkrankungen wie der Tyrosinämie Typ II assoziiert und können Untersuchungen zur Leberphysiologie, Aminosäurehomöostase und Signalgebung bei metabolischem Stress unterstützen.

TAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TAT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TAT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TAT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TAT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TAT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TAT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TAT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TAT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.