TARDBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401890-ACT

TARDBP kodiert TDP‑43, ein RNA-/DNA-bindendes Protein, das das Spleißen von Prä‑mRNA, die Stabilität von mRNA und deren Transport reguliert, mit zentralen Funktionen im neuronalen RNA‑Stoffwechsel und in der Dynamik von Stressgranula. Durch die Bindung an UG‑reiche RNA‑Motive moduliert TDP‑43 Programme des alternativen Spleißens und erhält die Integrität des Transkriptoms aufrecht; dadurch ist es mit Signalwegen verknüpft, die Proteostase, nukleozytoplasmatischen Transport und zelluläre Stressantworten steuern. Eine Fehlregulation der Lokalisation von TDP‑43 und seine Aggregation sind ein Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen, und verändertes TARDBP‑abhängiges Spleißen wurde mit krankheitsrelevanten Gen-Netzwerken in Verbindung gebracht. Daher wird TARDBP in humanen Zellmodellen intensiv untersucht, um Mechanismen der RNA‑Prozessierung, Neurotoxizität und Genexpressionskontrolle aufzuklären.

TARDBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TARDBP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TARDBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TARDBP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TARDBP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TARDBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TARDBP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TARDBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TARDBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TARDBP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.