Plasmide CRISPR d'Activation (h) Synaptotagmin VII: sc-404291-ACT

SYT7 code la synaptotagmine VII, une protéine membranaire sensible au Ca2+ qui régule l’exocytose dépendante du Ca2+ et la réparation membranaire via la fusion de vésicules médiée par les SNARE. Elle participe à l’exocytose des lysosomes sécrétoires, au rescellage de la membrane plasmique après une lésion et à la libération régulée de cargos dans des cellules immunitaires et de type neuronal, faisant le lien entre la signalisation calcique et le trafic vésiculaire. L’activité de la synaptotagmine VII influence des processus tels que la dynamique de libération des neurotransmetteurs, la sécrétion de cytokines et le trafic endosomal/lysosomal. Des altérations de l’expression ou de la fonction de SYT7 ont été associées à une sécrétion dérégulée et à des phénotypes de perturbation de l’homéostasie membranaire pertinents pour la neurobiologie, l’inflammation et les réponses cellulaires au stress.

Synaptotagmin VII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SYT7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Synaptotagmin VII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SYT7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SYT7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Synaptotagmin VII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SYT7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Synaptotagmin VII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Synaptotagmin VII dans les cellules tumorales présentant une expression de SYT7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.