STRAD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402311-ACT

STRADA kodiert STRAD, eine katalytisch inaktive Pseudokinase, die mit LKB1 (STK11) und dem Scaffold-Protein MO25 einen Komplex bildet, um die zytoplasmatische Lokalisation und Aktivierung von LKB1 zu fördern. Über diesen Komplex unterstützt STRAD Phosphorylierungskaskaden, die die Signalgebung AMPK-verwandter Kinasen, die zelluläre Energiesensorik, Polarität und Wachstumskontrolle beeinflussen – mit nachgelagerten Auswirkungen auf Prozesse wie die Organisation des Zytoskeletts und Stressantworten. Eine Störung oder veränderte Regulation von STRADA wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen sowie dysregulierten Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die sich mit Signalwegen überschneiden, die häufig in der Proliferations- und Migrationsbiologie untersucht werden. Daher wird STRAD oft als regulatorischer Knotenpunkt untersucht, der Kinase-Scaffolding, subzelluläre Lokalisation und kontextabhängige Transkriptionsprogramme miteinander verknüpft.

STRAD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STRADA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

STRAD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STRADA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STRADA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen STRAD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STRADA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von STRAD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des STRAD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STRADA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.