ST CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400733-ACT

SLC6A4 kodiert den natrium- und chloridabhängigen Serotonintransporter (ST, auch als SERT bekannt), einen Symporter der Plasmamembran, der serotonerge Signalübertragung durch Wiederaufnahme von 5‑Hydroxytryptamin aus dem extrazellulären Raum beendet. Durch die Regulation der Serotoninverfügbarkeit beeinflusst ST die Neurotransmission, die synaptische Plastizität und nachgeschaltete Signalnetzwerke, die mit cAMP/PKA- und MAPK‑abhängigen transkriptionellen Antworten verknüpft sind. Neben neuronalen Zellen beeinflusst die Aktivität von SLC6A4 auch periphere serotonerge Prozesse in Thrombozyten und Geweben des Gastrointestinaltrakts, die sich mit neuroimmunologischen und Stressreaktions‑Signalwegen überschneiden. Eine veränderte Expression oder Funktion von SLC6A4 ist mit einer erhöhten Anfälligkeit für neuropsychiatrische und verhaltensbezogene Phänotypen assoziiert und macht es zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien zur Regulation serotonerger Schaltkreise.

ST Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC6A4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ST Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC6A4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC6A4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ST-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC6A4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ST-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ST-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC6A4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.