Plásmido CRISPR de Activación (h) SQSTM1/p62: sc-400099-ACT

SQSTM1 codifica la sequestosoma 1 (p62), un adaptador multifuncional que conecta la carga ubiquitinada con la autofagia selectiva mediante su unión a LC3 y coordina la proteostasis a través de interacciones con el sistema ubiquitina–proteasoma. p62 es un nodo central de señalización en vías de respuesta al estrés, incluidas la señalización antioxidante KEAP1–NRF2 y la activación de NF-κB, y contribuye a la regulación de la apoptosis, la inflamación y la homeostasis metabólica. La expresión alterada o la agregación de SQSTM1/p62 se asocia con una disrupción del flujo autofágico y con estrés proteotóxico, características observadas en la neurodegeneración y otros trastornos que implican estrés celular crónico. Como andamio que integra degradación y señalización, SQSTM1 se estudia ampliamente por sus funciones en la formación de cuerpos de inclusión, el control de calidad mitocondrial y la regulación de la inmunidad innata.

SQSTM1/p62 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SQSTM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SQSTM1/p62 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SQSTM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SQSTM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SQSTM1/p62. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SQSTM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SQSTM1/p62 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SQSTM1/p62 en células tumorales con expresión de SQSTM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.