Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sprouty 4: sc-402081-ACT

SPRY4 code pour Sprouty 4, un inhibiteur intracellulaire de rétrocontrôle de la signalisation des récepteurs à activité tyrosine kinase, qui atténue la sortie en aval de la voie RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. En modulant l’intensité et la durée du signal après stimulation par des facteurs tels que FGF, EGF et VEGF, Sprouty 4 influence la prolifération, la différenciation, la migration et la morphogenèse de ramification dans de nombreux types cellulaires. Une expression altérée de SPRY4 ou une dérégulation de son contrôle a été associée à des réseaux de signalisation des facteurs de croissance perturbés, observés en oncologie et dans des troubles du développement, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de voie. Son rôle de frein dépendant du contexte sur la signalisation MAPK soutient également les recherches sur l’adaptation du signal, l’architecture de la rétroaction négative et la plasticité phénotypique.

Sprouty 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPRY4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sprouty 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPRY4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPRY4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sprouty 4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPRY4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sprouty 4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sprouty 4 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPRY4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.