SPNS2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432145-ACT

Mouse Spns2 kodiert SPNS2, einen multipass-Membrantransporter, der Sphingosin-1-phosphat (S1P) exportiert und so extrazelluläre S1P-Gradienten etabliert, die die Signalübertragung über S1P-Rezeptoren prägen. Durch die Kontrolle der S1P-Verfügbarkeit beeinflusst SPNS2 im Rahmen des breiteren Sphingolipid-Stoffwechselnetzwerks den Lymphozytenverkehr, die Regulation der Endothelbarriere, angiogene Signale und die Rekrutierung entzündlicher Zellen. Störungen des SPNS2-vermittelten S1P-Transports wurden mit veränderter Immunhomöostase und vaskulärer Biologie in Verbindung gebracht, was Spns2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Immunregulation, entzündungsassoziierten Phänotypen und mikroenvironmentaler Signalgebung macht. In Mausmodellen wird die Spns2-Aktivität häufig im Kontext gewebespezifischer S1P-Flüsse, des Auswanderns von Immunzellen und vaskulärer Entwicklungswege untersucht.

SPNS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Spns2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPNS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Spns2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Spns2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPNS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Spns2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPNS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPNS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Spns2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.