Plásmido CRISPR de Activación (h) spectrin α I: sc-403563-ACT

SPTA1 codifica la espectrina αI, un componente central del citoesqueleto de la membrana eritrocitaria que forma heterotetrámeros con la β-espectrina para generar una red flexible que sostiene la forma del glóbulo rojo, su deformabilidad y su estabilidad mecánica. Este armazón se acopla a complejos de unión con actina y se ancla a proteínas de membrana mediante interacciones con adaptadores, integrando la organización del citoesqueleto con la integridad de la membrana bajo estrés de cizallamiento. La alteración del ensamblaje de la espectrina o de la conectividad entre membrana y citoesqueleto compromete la resiliencia del eritrocito y se ha implicado en trastornos hemolíticos hereditarios, como la esferocitosis hereditaria y la eliptocitosis hereditaria. Como regulador estructural, SPTA1 también se estudia en vías que controlan la dinámica del citoesqueleto, el tráfico de membranas y las respuestas biomecánicas.

spectrin α I El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SPTA1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

spectrin α I El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SPTA1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SPTA1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de spectrin α I. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SPTA1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de spectrin α I en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía spectrin α I en células tumorales con expresión de SPTA1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.