SPATA18 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407015-ACT

Das humane SPATA18 kodiert einen mitochondrienassoziierten Faktor, der an der Qualitätskontrolle der Mitochondrien sowie an der stressinduzierten Entfernung geschädigter Mitochondrien über mitophagieähnliche Prozesse beteiligt ist. Es steht in Zusammenhang mit zellulären Antworten auf oxidativen Stress und der Aufrechterhaltung der Integrität der Mitochondrienmembran und verknüpft die SPATA18-Aktivität mit übergeordneten Signalwegen, die Energiestoffwechsel, Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies und Organellumsatz steuern. Eine veränderte Regulation von SPATA18 wurde in Kontexten zellulären Stresses und von Programmen zur Genomaufrechterhaltung berichtet, wodurch es für Studien zu mitochondrialer Dysfunktion und proliferationsassoziierten Phänotypen relevant ist. Diese Funktionen machen SPATA18 zu einem geeigneten Ansatzpunkt, um zu untersuchen, wie mitochondriale Überwachungsmechanismen mit Zellschicksalsentscheidungen und krankheitsassoziiertem metabolischem Remodeling zusammenwirken.

SPATA18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPATA18-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPATA18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPATA18-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPATA18-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPATA18-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPATA18-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPATA18-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPATA18-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPATA18-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.