Plásmido CRISPR de Activación (m) Spastin: sc-424512-ACT

Mouse Spast (Spastin) codifica una ATPasa AAA que corta microtúbulos para remodelar el citoesqueleto y regular el transporte axonal, el crecimiento de neuritas y la dinámica del huso mitótico. La actividad de spastina se integra con el tráfico endosomal y el modelado de membranas en la red de retículo endoplásmico y endosomas, lo que ayuda a coordinar el recambio de microtúbulos con la distribución de orgánulos. La alteración de la función de SPAST está fuertemente asociada a fenotipos neurodegenerativos, incluida la paraplejia espástica hereditaria, y se estudia ampliamente para comprender los mecanismos de la axonopatía y la vulnerabilidad del tracto corticoespinal. En modelos murinos, los cambios en la expresión de Spast ofrecen una vía manejable para investigar el mantenimiento neuronal dependiente de microtúbulos y las respuestas al estrés.

Spastin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Spast sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Spastin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Spast en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Spast, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Spastin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Spast y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Spastin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Spastin en células tumorales con expresión de Spast silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.