SPARC CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423101-ACT

Mouse Sparc kodiert SPARC, ein sezerniertes, matrizelluläres Glykoprotein, das die Organisation der extrazellulären Matrix (ECM), die Kollagenablagerung und Zell–Matrix-Interaktionen moduliert. SPARC reguliert Adhäsion, Migration und Proliferation, indem es die Integrin-Signalgebung und die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren beeinflusst, und wirkt damit auf Prozesse wie Wundheilung, Angiogenese und Gewebeumbau ein. Es ist häufig mit Signalwegen verknüpft, die Fibrose und stromale Antworten steuern, und seine Fehlregulation wird mit einer veränderten ECM-Homöostase und entzündlichen Mikroumgebungen in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen SPARC zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Verhalten mesenchymaler Zellen, ECM-getriebene Signal-Crosstalks und die Regulation der Mikroumgebung in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

SPARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sparc-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPARC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sparc-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sparc-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPARC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sparc-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPARC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPARC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sparc-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.