Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPA-L3: sc-411666-ACT

Le gène humain **SIPA1L3** code **SPA-L3**, un échafaudage de signalisation multidomaine qui interagit avec les réseaux de régulation des petites GTPases et organise des assemblages protéiques au niveau de la membrane plasmique et du cytosquelette cortical. Par son association avec des composants des voies Rap/Ras et des complexes liés à l’actine, SPA-L3 est en mesure d’influencer la polarité cellulaire, l’adhérence et le remodelage dynamique du cytosquelette qui façonnent la migration et la morphogenèse. Une régulation altérée de ces processus est fréquemment impliquée dans le comportement invasif et une architecture tissulaire aberrante, faisant de **SIPA1L3** un locus utile pour étudier le recâblage des voies dans des états cellulaires pertinents pour la maladie. L’expression de **SIPA1L3** et la connectivité de son réseau sont donc informatives dans des modèles qui interrogent la signalisation proximale à la membrane, le contrôle du cytosquelette et la plasticité phénotypique.

SPA-L3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SIPA1L3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPA-L3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SIPA1L3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SIPA1L3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPA-L3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SIPA1L3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPA-L3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPA-L3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SIPA1L3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.