SP-B CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422901-ACT

Sftpb kodiert das Surfactant-Protein B (SP-B), eine hydrophobe Komponente des pulmonalen Surfactants, die für die Verpackung und Verteilung von Phospholipiden erforderlich ist, welche während der Atmung die Oberflächenspannung in den Alveolen stabilisieren. In murinen alveolären Typ-II-Epithelzellen wird SP-B aus einem Proprotein prozessiert und über sekretorische Wege sowie Lamellarkörperchen-Transportwege weitergeleitet, um die Surfactant-Homöostase und die Lungencompliance zu unterstützen. Die Sftpb-Aktivität ist eng mit Programmen der epithelialen Differenzierung und Prozessen des Lipidhandlings verknüpft, die die Surfactant-Biogenese und den Umsatz koordinieren. Eine veränderte SP-B-Expression oder -Prozessierung ist mit gestörter Surfactant-Funktion und Phänotypen verbunden, die in experimentellen Modellen für neonatale respiratorische Insuffizienz, interstitielle Lungenerkrankungen und eine erhöhte Anfälligkeit für alveoläre Schädigungen relevant sind.

SP-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Sftpb-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SP-B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Sftpb-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Sftpb-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SP-B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Sftpb-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SP-B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SP-B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Sftpb-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.