Smurf2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401431-ACT

SMURF2 kodiert Smurf2, eine HECT-Domänen-E3-Ubiquitin-Ligase, die den Proteinumsatz reguliert, indem sie die Ubiquitinierung von Signal- und Zellzykluskomponenten katalysiert. Smurf2 ist vor allem dafür bekannt, die TGF-β/BMP-Signalübertragung über eine ubiquitinabhängige Kontrolle von Signalweg-Mediatoren zu modulieren und dadurch die epithelial–mesenchymale Transition, Differenzierung und Gewebehomöostase zu beeinflussen. Zudem ist Smurf2 an DNA-Schadensantworten und seneszenzassoziierten Programmen beteiligt und verknüpft so Ubiquitin-Signale mit Genomstabilität und Stressanpassung. Eine fehlregulierte SMURF2-Aktivität und ein verändertes Gleichgewicht der Signalwege wurden mit kontextabhängigen Veränderungen der Tumorprogression, fibroseassoziierter Signalgebung und entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, was SMURF2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Signalweg-Kreuzregulation macht.

Smurf2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMURF2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smurf2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMURF2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMURF2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smurf2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMURF2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smurf2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smurf2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMURF2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.